مائکروبیل میٹا پروٹومکس: نمونہ پروسیسنگ، ڈیٹا اکٹھا کرنے سے لے کر ڈیٹا تجزیہ تک

وو اینہوئی، کیاو لیانگ*

شعبہ کیمسٹری، فوڈان یونیورسٹی، شنگھائی 200433، چین

مائکروجنزموں کا انسانی بیماریوں اور صحت سے گہرا تعلق ہے۔ مائکروبیل کمیونٹیز اور ان کے افعال کی ساخت کو کیسے سمجھنا ایک بڑا مسئلہ ہے جس کا فوری مطالعہ کرنے کی ضرورت ہے۔ حالیہ برسوں میں، میٹا پروٹومکس مائکروجنزموں کی ساخت اور کام کا مطالعہ کرنے کا ایک اہم تکنیکی ذریعہ بن گیا ہے۔ تاہم، مائکروبیل کمیونٹی کے نمونوں کی پیچیدگی اور اعلی تفاوت کی وجہ سے، نمونے کی پروسیسنگ، ماس سپیکٹرو میٹری ڈیٹا کا حصول اور ڈیٹا کا تجزیہ تین بڑے چیلنجز بن گئے ہیں جن کا فی الحال میٹا پروٹومکس کو سامنا ہے۔ میٹا پروٹومکس تجزیہ میں، مختلف قسم کے نمونوں کے پہلے سے علاج کو بہتر بنانا اور مختلف مائکروبیل علیحدگی، افزودگی، نکالنے اور لیسیز اسکیموں کو اپنانا اکثر ضروری ہوتا ہے۔ کسی ایک نوع کے پروٹوم کی طرح، میٹا پروٹومکس میں ماس سپیکٹرو میٹری ڈیٹا کے حصول کے طریقوں میں ڈیٹا پر منحصر حصول (DDA) موڈ اور ڈیٹا سے آزاد حصول (DIA) موڈ شامل ہیں۔ ڈی آئی اے ڈیٹا ایکوزیشن موڈ نمونے کی پیپٹائڈ معلومات کو مکمل طور پر اکٹھا کر سکتا ہے اور اس میں ترقی کی بڑی صلاحیت ہے۔ تاہم، metaproteome نمونوں کی پیچیدگی کی وجہ سے، اس کا DIA ڈیٹا تجزیہ ایک بڑا مسئلہ بن گیا ہے جو metaproteomics کی گہری کوریج میں رکاوٹ ہے۔ اعداد و شمار کے تجزیہ کے لحاظ سے، سب سے اہم مرحلہ پروٹین کی ترتیب کے ڈیٹا بیس کی تعمیر ہے۔ ڈیٹا بیس کی جسامت اور مکمل ہونے کا نہ صرف شناختوں کی تعداد پر بڑا اثر پڑتا ہے، بلکہ انواع اور فنکشنل سطحوں پر تجزیہ کو بھی متاثر کرتا ہے۔ فی الحال، میٹا پروٹوم ڈیٹا بیس کی تعمیر کے لیے گولڈ اسٹینڈرڈ میٹاجینوم پر مبنی ایک پروٹین سیکوینس ڈیٹا بیس ہے۔ ایک ہی وقت میں، تکراری تلاش پر مبنی عوامی ڈیٹا بیس فلٹرنگ کا طریقہ بھی مضبوط عملی قدر کا حامل ثابت ہوا ہے۔ مخصوص اعداد و شمار کے تجزیہ کی حکمت عملیوں کے نقطہ نظر سے، پیپٹائڈ پر مبنی DIA ڈیٹا تجزیہ کے طریقوں نے ایک مکمل مرکزی دھارے پر قبضہ کر لیا ہے۔ گہری سیکھنے اور مصنوعی ذہانت کی ترقی کے ساتھ، یہ میکرو پروٹومک ڈیٹا کے تجزیہ کی درستگی، کوریج اور تجزیہ کی رفتار کو بہت فروغ دے گا۔ ڈاون اسٹریم بائیو انفارمیٹکس تجزیہ کے لحاظ سے، حالیہ برسوں میں تشریحی ٹولز کا ایک سلسلہ تیار کیا گیا ہے، جو مائکروبیل کمیونٹیز کی ترکیب حاصل کرنے کے لیے پروٹین کی سطح، پیپٹائڈ کی سطح اور جین کی سطح پر پرجاتیوں کی تشریح کر سکتے ہیں۔ دوسرے اومکس طریقوں کے مقابلے میں، مائکروبیل کمیونٹیز کا فنکشنل تجزیہ میکرو پروٹومکس کی ایک منفرد خصوصیت ہے۔ میکرو پروٹومکس مائکروبیل کمیونٹیز کے ملٹی اومکس تجزیہ کا ایک اہم حصہ بن گیا ہے، اور اب بھی کوریج کی گہرائی، پتہ لگانے کی حساسیت، اور ڈیٹا کے تجزیہ کی تکمیل کے لحاظ سے بہت زیادہ ترقی کی صلاحیت رکھتا ہے۔

01 نمونہ قبل از علاج

اس وقت میٹا پروٹومکس ٹیکنالوجی کو انسانی مائکرو بایوم، مٹی، خوراک، سمندر، فعال کیچڑ اور دیگر شعبوں کی تحقیق میں بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔ کسی ایک نوع کے پروٹوم تجزیہ کے مقابلے میں، پیچیدہ نمونوں کے میٹا پروٹوم کے نمونے کی پری ٹریٹمنٹ کو زیادہ چیلنجز کا سامنا ہے۔ اصل نمونوں میں مائکروبیل مرکب پیچیدہ ہے، کثرت کی متحرک حد بڑی ہے، مختلف قسم کے مائکروجنزموں کی سیل وال کی ساخت بہت مختلف ہے، اور نمونوں میں اکثر میزبان پروٹین اور دیگر نجاست کی ایک بڑی مقدار ہوتی ہے۔ لہذا، metaproteome کے تجزیہ میں، یہ اکثر مختلف قسم کے نمونوں کو بہتر بنانے اور مختلف مائکروبیل علیحدگی، افزودگی، نکالنے اور lysis اسکیموں کو اپنانے کے لئے ضروری ہے.

مختلف نمونوں سے مائکروبیل میٹاپروٹیومز کو نکالنے میں کچھ مماثلتوں کے ساتھ ساتھ کچھ اختلافات بھی ہیں، لیکن فی الحال مختلف قسم کے میٹاپروٹیوم نمونوں کے لیے ایک متحد پری پروسیسنگ عمل کا فقدان ہے۔

02 بڑے پیمانے پر سپیکٹرو میٹری ڈیٹا کا حصول

شاٹگن پروٹوم تجزیہ میں، پریٹریٹمنٹ کے بعد پیپٹائڈ مرکب کو پہلے کرومیٹوگرافک کالم میں الگ کیا جاتا ہے، اور پھر آئنائزیشن کے بعد ڈیٹا کے حصول کے لیے ماس اسپیکٹومیٹر میں داخل ہوتا ہے۔ واحد نوع کے پروٹوم تجزیہ کی طرح، میکرو پروٹوم تجزیہ میں ماس اسپیکٹرو میٹری ڈیٹا کے حصول کے طریقوں میں DDA موڈ اور DIA موڈ شامل ہیں۔

ماس سپیکٹرو میٹری آلات کی مسلسل تکرار اور اپ ڈیٹ کے ساتھ، اعلیٰ حساسیت اور ریزولوشن والے ماس سپیکٹرو میٹری آلات میٹا پروٹوم پر لاگو ہوتے ہیں، اور میٹا پروٹومی تجزیہ کی کوریج کی گہرائی میں بھی مسلسل بہتری آتی ہے۔ ایک طویل عرصے سے، Orbitrap کی سربراہی میں ہائی ریزولوشن ماس سپیکٹرو میٹری آلات کی ایک سیریز میٹا پروٹوم میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی رہی ہے۔

اصل متن کا جدول 1 میٹا پروٹومکس پر 2011 سے لے کر اب تک کے نمونے کی قسم، تجزیہ کی حکمت عملی، ماس سپیکٹرو میٹری آلہ، حصول کا طریقہ، تجزیہ سافٹ ویئر، اور شناخت کی تعداد کے لحاظ سے کچھ نمائندہ مطالعات کو ظاہر کرتا ہے۔

03 ماس سپیکٹرو میٹری ڈیٹا کا تجزیہ

3.1 DDA ڈیٹا تجزیہ کی حکمت عملی

3.1.1 ڈیٹا بیس کی تلاش

3.1.2ڈی نووترتیب کی حکمت عملی

3.2 DIA ڈیٹا تجزیہ کی حکمت عملی

04 پرجاتیوں کی درجہ بندی اور فنکشنل تشریح

مختلف ٹیکونومک سطحوں پر مائکروبیل کمیونٹیز کی تشکیل مائکرو بایوم ریسرچ کے کلیدی تحقیقی شعبوں میں سے ایک ہے۔ حالیہ برسوں میں، مائکروبیل کمیونٹیز کی تشکیل حاصل کرنے کے لیے پروٹین کی سطح، پیپٹائڈ کی سطح، اور جین کی سطح پر پرجاتیوں کی تشریح کے لیے تشریحی ٹولز کا ایک سلسلہ تیار کیا گیا ہے۔

فنکشنل تشریح کا نچوڑ یہ ہے کہ ٹارگٹ پروٹین کی ترتیب کا فنکشنل پروٹین سیکوینس ڈیٹا بیس سے موازنہ کیا جائے۔ جین فنکشن ڈیٹا بیس جیسے کہ GO، COG، KEGG، eggNOG، وغیرہ کا استعمال کرتے ہوئے، مختلف فنکشنل تشریحی تجزیے ان پروٹینوں پر کیے جا سکتے ہیں جن کی نشاندہی میکرو پروٹوم کے ذریعے کی جاتی ہے۔ تشریحی ٹولز میں Blast2GO، DAVID، KOBAS وغیرہ شامل ہیں۔

05 خلاصہ اور آؤٹ لک

مائکروجنزم انسانی صحت اور بیماری میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ حالیہ برسوں میں، میٹا پروٹومکس مائکروبیل کمیونٹیز کے کام کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک اہم تکنیکی ذریعہ بن گیا ہے۔ میٹا پروٹومکس کا تجزیاتی عمل سنگل اسپیسز پروٹومکس جیسا ہی ہے، لیکن میٹا پروٹومکس کے ریسرچ آبجیکٹ کی پیچیدگی کی وجہ سے، ہر تجزیہ کے مرحلے میں مخصوص تحقیقی حکمت عملیوں کو اپنانے کی ضرورت ہوتی ہے، نمونہ پریٹریٹمنٹ، ڈیٹا کے حصول سے لے کر ڈیٹا کے تجزیہ تک۔ فی الحال، علاج سے پہلے کے طریقوں میں بہتری، ماس سپیکٹرو میٹری ٹیکنالوجی کی مسلسل جدت اور بائیو انفارمیٹکس کی تیز رفتار ترقی کی بدولت میٹا پروٹومکس نے شناخت کی گہرائی اور اطلاق کے دائرہ کار میں بہت ترقی کی ہے۔

میکروپروٹیوم نمونوں کے پہلے سے علاج کے عمل میں، نمونے کی نوعیت کو پہلے غور کرنا چاہیے۔ ماحولیاتی خلیوں اور پروٹینوں سے مائکروجنزموں کو کیسے الگ کرنا ہے میکرو پروٹوم کو درپیش کلیدی چیلنجوں میں سے ایک ہے، اور علیحدگی کی کارکردگی اور مائکروبیل نقصان کے درمیان توازن ایک فوری مسئلہ ہے جس کو حل کیا جانا چاہیے۔ دوم، مائکروجنزموں کے پروٹین کو نکالنے میں مختلف بیکٹیریا کی ساختی نسبت کی وجہ سے ہونے والے فرق کو مدنظر رکھنا چاہیے۔ ٹریس رینج میں میکرو پروٹوم کے نمونوں کو بھی مخصوص پری علاج کے طریقوں کی ضرورت ہوتی ہے۔

ماس سپیکٹرو میٹری آلات کے لحاظ سے، مین سٹریم ماس سپیکٹرو میٹری آلات میں آربیٹریپ ماس اینالائزرز جیسے LTQ-Orbitrap اور Q Exactive کی بنیاد پر ماس سپیکٹرو میٹر سے آئن موبلٹی کے ساتھ ساتھ ٹائم آف فلائٹ ماس اینالائزرز جیسے timsTOF پرو پر منتقلی ہوئی ہے۔ . آئن موبلٹی ڈائمینشن کی معلومات والے آلات کی timsTOF سیریز میں پتہ لگانے کی اعلی درستگی، کم پتہ لگانے کی حد، اور اچھی تکرار کی صلاحیت ہے۔ وہ دھیرے دھیرے مختلف تحقیقی شعبوں میں اہم آلات بن گئے ہیں جن کے لیے بڑے پیمانے پر سپیکٹرومیٹری کا پتہ لگانے کی ضرورت ہوتی ہے، جیسے کہ پروٹوم، میٹا پروٹوم، اور ایک ہی نوع کے میٹابولوم۔ یہ بات قابل غور ہے کہ ایک طویل عرصے سے، ماس سپیکٹرومیٹری آلات کی متحرک رینج نے میٹا پروٹوم ریسرچ کی پروٹین کوریج کی گہرائی کو محدود کر دیا ہے۔ مستقبل میں، بڑے متحرک رینج والے ماس سپیکٹرو میٹری آلات میٹا پروٹوم میں پروٹین کی شناخت کی حساسیت اور درستگی کو بہتر بنا سکتے ہیں۔

بڑے پیمانے پر اسپیکٹومیٹری ڈیٹا کے حصول کے لیے، اگرچہ ڈی آئی اے ڈیٹا ایکوزیشن موڈ کو ایک ہی نوع کے پروٹوم میں بڑے پیمانے پر اپنایا گیا ہے، لیکن زیادہ تر موجودہ میکرو پروٹوم تجزیے اب بھی ڈی ڈی اے ڈیٹا ایکوزیشن موڈ کا استعمال کرتے ہیں۔ ڈی آئی اے ڈیٹا ایکوزیشن موڈ نمونے کی فریگمنٹ آئن معلومات کو مکمل طور پر حاصل کر سکتا ہے، اور ڈی ڈی اے ڈیٹا ایکوزیشن موڈ کے مقابلے میں، اس میں میکرو پروٹوم نمونے کی پیپٹائڈ معلومات کو مکمل طور پر حاصل کرنے کی صلاحیت ہے۔ تاہم، ڈی آئی اے ڈیٹا کی زیادہ پیچیدگی کی وجہ سے، ڈی آئی اے میکرو پروٹوم ڈیٹا کے تجزیے میں اب بھی بڑی مشکلات کا سامنا ہے۔ مصنوعی ذہانت اور گہری سیکھنے کی ترقی سے DIA ڈیٹا کے تجزیہ کی درستگی اور مکمل ہونے کی توقع ہے۔

میٹا پروٹومکس کے ڈیٹا کے تجزیے میں، ایک اہم مرحلہ پروٹین کی ترتیب کے ڈیٹا بیس کی تعمیر ہے۔ آنتوں کے پودوں جیسے مشہور تحقیقی شعبوں کے لیے، آنتوں کے مائکروبیل ڈیٹا بیس جیسے IGC اور HMP کا استعمال کیا جا سکتا ہے، اور اچھے شناختی نتائج حاصل کیے گئے ہیں۔ زیادہ تر دیگر میٹا پروٹومکس کے تجزیوں کے لیے، ڈیٹا بیس کی تعمیر کی سب سے مؤثر حکمت عملی اب بھی میٹجینومک سیکوینسنگ ڈیٹا کی بنیاد پر نمونہ کے لیے مخصوص پروٹین سیکوینس ڈیٹا بیس قائم کرنا ہے۔ اعلی پیچیدگی اور بڑی متحرک رینج کے ساتھ مائکروبیل کمیونٹی کے نمونوں کے لیے، کم کثرت والی پرجاتیوں کی شناخت کو بڑھانے کے لیے ترتیب کی گہرائی کو بڑھانا ضروری ہے، اس طرح پروٹین کی ترتیب کے ڈیٹا بیس کی کوریج کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔ جب ڈیٹا کو ترتیب دینے کی کمی ہوتی ہے، تو عوامی ڈیٹا بیس کو بہتر بنانے کے لیے ایک تکراری تلاش کا طریقہ استعمال کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، تکراری تلاش FDR کوالٹی کنٹرول کو متاثر کر سکتی ہے، لہذا تلاش کے نتائج کو احتیاط سے چیک کرنے کی ضرورت ہے۔ اس کے علاوہ، میٹا پروٹومکس تجزیہ میں روایتی FDR کوالٹی کنٹرول ماڈلز کا اطلاق اب بھی قابل غور ہے۔ تلاش کی حکمت عملی کے لحاظ سے، ہائبرڈ سپیکٹرل لائبریری کی حکمت عملی DIA میٹا پروٹومکس کی کوریج کی گہرائی کو بہتر بنا سکتی ہے۔ حالیہ برسوں میں، گہرائی سے سیکھنے کی بنیاد پر تیار کردہ پیشین گوئی شدہ سپیکٹرل لائبریری نے DIA پروٹومکس میں اعلیٰ کارکردگی دکھائی ہے۔ تاہم، metaproteome ڈیٹا بیس میں اکثر پروٹین کے لاکھوں اندراجات ہوتے ہیں، جس کے نتیجے میں بڑے پیمانے پر پیش گوئی کی گئی سپیکٹرل لائبریریاں ہوتی ہیں، کمپیوٹنگ کے بہت سارے وسائل استعمال کرتے ہیں، اور اس کے نتیجے میں تلاش کی ایک بڑی جگہ ہوتی ہے۔ اس کے علاوہ، metaproteomes میں پروٹین کی ترتیب کے درمیان مماثلت بہت زیادہ مختلف ہوتی ہے، جس سے اسپیکٹرل لائبریری کی پیشن گوئی ماڈل کی درستگی کو یقینی بنانا مشکل ہو جاتا ہے، اس لیے میٹا پروٹومکس میں پیشین گوئی شدہ اسپیکٹرل لائبریریوں کو بڑے پیمانے پر استعمال نہیں کیا گیا ہے۔ اس کے علاوہ، انتہائی ترتیب سے ملتے جلتے پروٹینوں کے میٹا پروٹومکس تجزیہ پر لاگو کرنے کے لیے نئی پروٹین کا اندازہ اور درجہ بندی کی تشریح کی حکمت عملی تیار کرنے کی ضرورت ہے۔

خلاصہ یہ کہ ایک ابھرتی ہوئی مائکرو بایوم ریسرچ ٹیکنالوجی کے طور پر، میٹا پروٹومکس ٹیکنالوجی نے اہم تحقیقی نتائج حاصل کیے ہیں اور اس میں ترقی کی بہت بڑی صلاحیت بھی ہے۔