یہ مضمون آپ کو سکھاتا ہے کہ مائع کرومیٹوگرافی کالم کا انتخاب کیسے کریں۔

مائع کرومیٹوگرافی خام مال، انٹرمیڈیٹس، تیاریوں اور پیکیجنگ مواد میں ہر جزو کے مواد اور نجاست کی جانچ کرنے کا بنیادی طریقہ ہے، لیکن بہت سے مادوں پر انحصار کرنے کے لیے معیاری طریقے نہیں ہوتے، اس لیے نئے طریقے تیار کرنا ناگزیر ہے۔ مائع مرحلے کے طریقوں کی ترقی میں، کرومیٹوگرافک کالم مائع کرومیٹوگرافی کا بنیادی حصہ ہے، لہذا ایک مناسب کرومیٹوگرافک کالم کا انتخاب کیسے کیا جائے یہ اہم ہے۔ اس مضمون میں، مصنف تین پہلوؤں سے لیکویڈ کرومیٹوگرافی کالم کا انتخاب کرنے کا طریقہ بتائے گا: مجموعی خیالات، غور و فکر اور اطلاق کا دائرہ۔

A. مائع کرومیٹوگرافی کالموں کو منتخب کرنے کے لیے مجموعی خیالات

1. تجزیہ کار کی طبعی اور کیمیائی خصوصیات کا اندازہ کریں: جیسے کیمیائی ساخت، حل پذیری، استحکام (جیسے کہ آیا اسے آکسائڈائزڈ/کم/ہائیڈرولائز کرنا آسان ہے)، تیزابیت اور الکلائنٹی وغیرہ، خاص طور پر کیمیائی ساخت کلیدی حیثیت رکھتی ہے۔ خصوصیات کا تعین کرنے کا عنصر، جیسے کہ کنجوگیٹڈ گروپ میں مضبوط الٹرا وایلیٹ جذب اور مضبوط فلوروسینس ہے؛

2. تجزیہ کے مقصد کا تعین کریں: کیا اعلی علیحدگی، اعلی کالم کی کارکردگی، مختصر تجزیہ کا وقت، اعلی حساسیت، ہائی پریشر مزاحمت، طویل کالم زندگی، کم قیمت، وغیرہ کی ضرورت ہے؛

1. ایک مناسب کرومیٹوگرافک کالم کا انتخاب کریں: کرومیٹوگرافک فلر کی ساخت، جسمانی اور کیمیائی خصوصیات کو سمجھیں، جیسے ذرہ کا سائز، تاکنا کا سائز، درجہ حرارت برداشت، پی ایچ رواداری، تجزیہ کار کی جذب وغیرہ۔

1. مائع کرومیٹوگرافی کالموں کے انتخاب کے لیے غور و فکر

یہ باب ان عوامل پر بحث کرے گا جو کرومیٹوگرافی کالم کا انتخاب کرتے وقت خود کرومیٹوگرافی کالم کی طبعی اور کیمیائی خصوصیات کے نقطہ نظر سے غور کیا جانا چاہیے۔ 2.1 فلر میٹرکس

2.1.1 سلیکا جیل میٹرکس زیادہ تر مائع کرومیٹوگرافی کالموں کا فلر میٹرکس سلیکا جیل ہے۔ اس قسم کے فلر میں اعلی پاکیزگی، کم لاگت، اعلی مکینیکل طاقت ہوتی ہے، اور گروپس میں ترمیم کرنا آسان ہے (جیسے فینائل بانڈنگ، امینو بانڈنگ، سائانو بانڈنگ، وغیرہ)، لیکن پی ایچ ویلیو اور درجہ حرارت کی حد محدود ہے: زیادہ تر سیلیکا جیل میٹرکس فلرز کی پی ایچ رینج 2 سے 8 ہے، لیکن خاص طور پر تبدیل شدہ سلیکا جیل بانڈڈ فیزز کی پی ایچ رینج 1.5 سے 10 تک وسیع ہوسکتی ہے، اور خاص طور پر تبدیل شدہ سلیکا جیل بانڈڈ فیزز بھی ہیں جو کم پی ایچ پر مستحکم ہوتے ہیں، جیسے Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18، جو pH 1 سے 8 پر مستحکم ہے۔ سلیکا جیل میٹرکس کے اوپری درجہ حرارت کی حد عام طور پر 60 ℃ ہے، اور کچھ کرومیٹوگرافی کالم اعلی پی ایچ پر 40 ℃ کے درجہ حرارت کو برداشت کر سکتے ہیں۔

2.1.2 پولیمر میٹرکس پولیمر فلرز زیادہ تر پولی اسٹیرین-ڈیوینائل بینزین یا پولی میتھ کرائیلیٹ ہوتے ہیں۔ ان کے فوائد یہ ہیں کہ وہ پی ایچ کی وسیع رینج کو برداشت کر سکتے ہیں - انہیں 1 سے 14 کی حد میں استعمال کیا جا سکتا ہے، اور وہ زیادہ درجہ حرارت کے خلاف زیادہ مزاحم ہیں (80 °C سے اوپر پہنچ سکتے ہیں)۔ سیلیکا پر مبنی C18 فلرز کے مقابلے میں، اس قسم کے فلر میں ہائیڈروفوبیسیٹی مضبوط ہوتی ہے، اور میکرو پورس پولیمر نمونوں جیسے پروٹین کو الگ کرنے میں بہت موثر ہے۔ اس کے نقصانات یہ ہیں کہ کالم کی کارکردگی کم ہے اور مکینیکل طاقت سلکا پر مبنی فلرز کی نسبت کمزور ہے۔ 2.2 ذرہ کی شکل

زیادہ تر جدید HPLC فلرز کروی ذرات ہوتے ہیں، لیکن بعض اوقات یہ فاسد ذرات ہوتے ہیں۔ کروی ذرات کم کالم دباؤ، اعلی کالم کی کارکردگی، استحکام اور طویل زندگی فراہم کر سکتے ہیں؛ جب ہائی ویسکوسیٹی موبائل فیزز (جیسے فاسفورک ایسڈ) استعمال کرتے ہیں یا جب نمونہ کا محلول چپکنے والا ہوتا ہے تو، فاسد ذرات کی سطح کا ایک بڑا مخصوص رقبہ ہوتا ہے، جو دو مرحلوں کی مکمل کارروائی کے لیے زیادہ سازگار ہوتا ہے، اور قیمت نسبتاً کم ہوتی ہے۔ 2.3 ذرات کا سائز

ذرہ کا سائز جتنا چھوٹا ہوگا، کالم کی کارکردگی اتنی ہی زیادہ ہوگی اور علیحدگی اتنی ہی زیادہ ہوگی، لیکن ہائی پریشر کی مزاحمت اتنی ہی خراب ہوگی۔ سب سے زیادہ استعمال ہونے والا کالم 5 μm پارٹیکل سائز کا کالم ہے۔ اگر علیحدگی کی ضرورت زیادہ ہے تو، 1.5-3 μm فلر کا انتخاب کیا جا سکتا ہے، جو کچھ پیچیدہ میٹرکس اور کثیر اجزاء کے نمونوں کی علیحدگی کے مسئلے کو حل کرنے کے لیے موزوں ہے۔ UPLC 1.5 μm فلرز استعمال کر سکتا ہے۔ 10 μm یا اس سے بڑے پارٹیکل سائز فلرز اکثر نیم تیاری یا تیاری والے کالموں کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ 2.4 کاربن کا مواد

کاربن کا مواد سلکا جیل کی سطح پر بندھے ہوئے مرحلے کے تناسب سے مراد ہے، جو مخصوص سطح کے علاقے اور بانڈڈ فیز کوریج سے متعلق ہے۔ اعلی کاربن مواد اعلی کالم کی صلاحیت اور اعلی ریزولوشن فراہم کرتا ہے، اور اکثر پیچیدہ نمونوں کے لیے استعمال کیا جاتا ہے جن میں زیادہ علیحدگی کی ضرورت ہوتی ہے، لیکن دونوں مراحل کے درمیان طویل تعامل کے وقت کی وجہ سے، تجزیہ کا وقت طویل ہوتا ہے۔ کم کاربن مواد والے کرومیٹوگرافک کالموں میں تجزیہ کا وقت کم ہوتا ہے اور وہ مختلف انتخابی خصوصیات دکھا سکتے ہیں، اور اکثر ایسے سادہ نمونوں کے لیے استعمال ہوتے ہیں جن کے لیے تیز رفتار تجزیہ کی ضرورت ہوتی ہے اور ایسے نمونے جن کے لیے پانی کے مرحلے کی اعلی حالت کی ضرورت ہوتی ہے۔ عام طور پر، C18 کا کاربن مواد 7% سے 19% تک ہوتا ہے۔ 2.5 تاکنا سائز اور مخصوص سطح کا علاقہ

HPLC ادسورپشن میڈیا غیر محفوظ ذرات ہیں، اور زیادہ تر تعامل سوراخوں میں ہوتے ہیں۔ لہذا، انووں کو جذب کرنے اور الگ کرنے کے لئے سوراخوں میں داخل ہونا ضروری ہے.

تاکنا سائز اور مخصوص سطح کا رقبہ دو تکمیلی تصورات ہیں۔ چھوٹے تاکنا سائز کا مطلب ہے بڑی مخصوص سطح کا علاقہ، اور اس کے برعکس۔ سطح کا ایک بڑا مخصوص رقبہ نمونے کے مالیکیولز اور بانڈڈ مراحل کے درمیان تعامل کو بڑھا سکتا ہے، برقراری کو بڑھا سکتا ہے، نمونے کی لوڈنگ اور کالم کی صلاحیت کو بڑھا سکتا ہے، اور پیچیدہ اجزاء کو الگ کر سکتا ہے۔ مکمل طور پر غیر محفوظ فلرز اس قسم کے فلرز سے تعلق رکھتے ہیں۔ اعلی علیحدگی کی ضروریات کے ساتھ، یہ بڑے مخصوص سطح کے علاقے کے ساتھ فلرز کا انتخاب کرنے کی سفارش کی جاتی ہے؛ چھوٹی مخصوص سطح کا رقبہ کمر کے دباؤ کو کم کر سکتا ہے، کالم کی کارکردگی کو بہتر بنا سکتا ہے، اور توازن کے وقت کو کم کر سکتا ہے، جو کہ تدریجی تجزیہ کے لیے موزوں ہے۔ کور شیل فلرز اس قسم کے فلرز سے تعلق رکھتے ہیں۔ علیحدگی کو یقینی بنانے کی بنیاد پر، اعلی تجزیہ کی کارکردگی کے تقاضوں کے حامل افراد کے لیے سطح کے چھوٹے مخصوص رقبے کے ساتھ فلرز کا انتخاب کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔ 2.6 تاکنا حجم اور مکینیکل طاقت

تاکنا والیوم، جسے "پوری والیوم" بھی کہا جاتا ہے، فی یونٹ پارٹیکل کے باطل حجم کے سائز سے مراد ہے۔ یہ فلر کی مکینیکل طاقت کو اچھی طرح سے ظاہر کر سکتا ہے۔ بڑے تاکنا والیوم والے فلرز کی مکینیکل طاقت چھوٹے تاکنا والیوم والے فلرز کی نسبت قدرے کمزور ہے۔ 1.5 mL/g سے کم یا اس کے مساوی فلرز زیادہ تر HPLC علیحدگی کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں، جب کہ 1.5 mL/g سے زیادہ تاکنا والیوم والے فلرز بنیادی طور پر سالماتی اخراج کرومیٹوگرافی اور کم دباؤ والی کرومیٹوگرافی کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ 2.7 کیپنگ کی شرح

کیپنگ مرکبات اور بے نقاب سائلانول گروپس کے درمیان تعامل کی وجہ سے ہونے والی ٹیلنگ چوٹیوں کو کم کر سکتی ہے (جیسے الکلائن مرکبات اور سائلانول گروپس کے درمیان آئنک بانڈنگ، وین ڈیر والز فورسز اور تیزابی مرکبات اور سائلانول گروپوں کے درمیان ہائیڈروجن بانڈ)، اس طرح کالم کی کارکردگی اور چوٹی کی شکل کو بہتر بناتا ہے۔ . غیر کیپڈ بانڈڈ فیزز کیپڈ بانڈڈ فیزز کی نسبت مختلف سلیکٹیوٹیز پیدا کریں گے، خاص طور پر قطبی نمونوں کے لیے۔

1. مختلف مائع کرومیٹوگرافی کالمز کی درخواست کی گنجائش

یہ باب کچھ معاملات کے ذریعے مختلف قسم کے مائع کرومیٹوگرافی کالموں کے اطلاق کے دائرہ کار کو بیان کرے گا۔

3.1 ریورسڈ فیز C18 کرومیٹوگرافک کالم

C18 کالم سب سے زیادہ استعمال کیا جانے والا الٹا فیز کالم ہے، جو زیادہ تر نامیاتی مادوں کے مواد اور ناپاکی کے ٹیسٹ کو پورا کر سکتا ہے، اور یہ درمیانے قطبی، کمزور قطبی اور غیر قطبی مادوں پر لاگو ہوتا ہے۔ C18 کرومیٹوگرافک کالم کی قسم اور تصریح کو مخصوص علیحدگی کی ضروریات کے مطابق منتخب کیا جانا چاہیے۔ مثال کے طور پر، اعلی علیحدگی کی ضروریات والے مادوں کے لیے، 5 μm*4.6 mm*250 mm وضاحتیں اکثر استعمال ہوتی ہیں۔ پیچیدہ علیحدگی میٹرکس اور اسی طرح کی قطبیت والے مادوں کے لیے، 4 μm*4.6 mm*250 mm وضاحتیں یا چھوٹے ذرات کے سائز کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، مصنف نے celecoxib API میں دو genotoxic impurities کا پتہ لگانے کے لیے 3 μm*4.6 mm*250 mm کالم استعمال کیا۔ دونوں مادوں کی علیحدگی 2.9 تک پہنچ سکتی ہے، جو کہ بہترین ہے۔ اس کے علاوہ، علیحدگی کو یقینی بنانے کی بنیاد کے تحت، اگر تیز تجزیہ کی ضرورت ہو تو، 10 ملی میٹر یا 15 ملی میٹر کا ایک مختصر کالم اکثر منتخب کیا جاتا ہے۔ مثال کے طور پر، جب مصنف نے پائپراکوئن فاسفیٹ API میں جینٹوکسک نجاست کا پتہ لگانے کے لیے LC-MS/MS کا استعمال کیا، تو 3 μm*2.1 mm*100 mm کالم استعمال کیا گیا۔ ناپاکی اور مرکزی جزو کے درمیان علیحدگی 2.0 تھی، اور نمونے کا پتہ لگانے کو 5 منٹ میں مکمل کیا جا سکتا ہے۔ 3.2 ریورسڈ فیز فینائل کالم

فینائل کالم بھی الٹ فیز کالم کی ایک قسم ہے۔ اس قسم کے کالم میں خوشبودار مرکبات کے لیے مضبوط سلیکٹیوٹی ہوتی ہے۔ اگر عام C18 کالم سے ماپا جانے والے خوشبودار مرکبات کا ردعمل کمزور ہے، تو آپ فینائل کالم کو تبدیل کرنے پر غور کر سکتے ہیں۔ مثال کے طور پر، جب میں celecoxib API بنا رہا تھا، تو ایک ہی مینوفیکچرر کے فینائل کالم اور ایک ہی تصریح (تمام 5 μm*4.6 mm*250 mm) کے ذریعے ماپا جانے والے اہم جز کا ردعمل C18 کالم سے تقریباً 7 گنا تھا۔ 3.3 نارمل فیز کالم

ریورسڈ فیز کالم کے لیے ایک مؤثر ضمیمہ کے طور پر، نارمل فیز کالم انتہائی قطبی مرکبات کے لیے موزوں ہے۔ اگر الٹ فیز کالم میں 90% سے زیادہ آبی مرحلے کے ساتھ ایلوٹ کرتے وقت چوٹی ابھی بھی بہت تیز ہے، اور یہاں تک کہ سالوینٹ چوٹی کے قریب اور اوورلیپ ہوتی ہے، تو آپ نارمل فیز کالم کو تبدیل کرنے پر غور کر سکتے ہیں۔ اس قسم کے کالم میں ہلک کالم، امینو کالم، سائانو کالم وغیرہ شامل ہیں۔

3.3.1 ہلک کالم ہیلک کالم عام طور پر قطبی مادوں کے ردعمل کو بڑھانے کے لیے بانڈڈ الکائل چین میں ہائیڈرو فیلک گروپس کو سرایت کرتا ہے۔ اس قسم کا کالم شوگر کے مادوں کے تجزیہ کے لیے موزوں ہے۔ مصنف نے اس قسم کے کالم کو زائلوز اور اس کے مشتق مواد اور متعلقہ مادوں کو کرتے وقت استعمال کیا۔ xylose کے مشتق کے isomers کو بھی اچھی طرح سے الگ کیا جا سکتا ہے۔

3.3.2 امینو کالم اور سائانو کالم امینو کالم اور سائانو کالم بانڈڈ الکائل چین کے آخر میں بالترتیب امینو اور سائانو ترمیم کے تعارف کا حوالہ دیتے ہیں، خاص مادوں کے لیے سلیکٹیوٹی کو بہتر بنانے کے لیے: مثال کے طور پر، امینو کالم ایک اچھا انتخاب ہے۔ شکر، امینو ایسڈ، اڈوں، اور امائڈس کی علیحدگی کے لیے؛ کنجگیٹیڈ بانڈز کی موجودگی کی وجہ سے ہائیڈروجنیٹڈ اور غیر ہائیڈروجنیٹڈ ساختی ملتے جلتے مادوں کو الگ کرتے وقت سائانو کالم میں بہتر انتخاب ہوتا ہے۔ امینو کالم اور سائانو کالم کو اکثر عام فیز کالم اور ریورس فیز کالم کے درمیان تبدیل کیا جا سکتا ہے، لیکن بار بار سوئچنگ کی سفارش نہیں کی جاتی ہے۔ 3.4 چیرل کالم

چیرل کالم، جیسا کہ نام سے پتہ چلتا ہے، چیرل مرکبات کی علیحدگی اور تجزیہ کے لیے موزوں ہے، خاص طور پر فارماسیوٹیکل کے شعبے میں۔ اس قسم کے کالم پر غور کیا جا سکتا ہے جب روایتی ریورس فیز اور نارمل فیز کالم isomers کی علیحدگی حاصل نہیں کر سکتے۔ مثال کے طور پر، مصنف نے 1,2-diphenylethylenediamine کے دو isomers کو الگ کرنے کے لیے 5 μm*4.6 mm*250 mm چیرل کالم کا استعمال کیا: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine اور (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine، اور دونوں کے درمیان علیحدگی تقریباً 2.0 تک پہنچ گئی۔ تاہم، چیرل کالم دیگر قسم کے کالموں سے زیادہ مہنگے ہوتے ہیں، عام طور پر 1W+/piece۔ اگر ایسے کالموں کی ضرورت ہو تو یونٹ کو کافی بجٹ بنانے کی ضرورت ہے۔ 3.5 آئن ایکسچینج کالم

آئن ایکسچینج کالم چارج شدہ آئنوں کی علیحدگی اور تجزیہ کے لیے موزوں ہیں، جیسے آئنز، پروٹین، نیوکلک ایسڈز، اور کچھ شوگر مادہ۔ فلر کی قسم کے مطابق، وہ کیشن ایکسچینج کالم، اینون ایکسچینج کالم، اور مضبوط کیشن ایکسچینج کالمز میں تقسیم ہوتے ہیں۔

کیشن ایکسچینج کالموں میں کیلشیم پر مبنی اور ہائیڈروجن پر مبنی کالم شامل ہیں، جو بنیادی طور پر کیشنک مادوں جیسے امینو ایسڈز کے تجزیہ کے لیے موزوں ہیں۔ مثال کے طور پر، مصنف نے فلشنگ محلول میں کیلشیم گلوکوونیٹ اور کیلشیم ایسیٹیٹ کا تجزیہ کرتے وقت کیلشیم پر مبنی کالم استعمال کیے ہیں۔ دونوں مادوں کا λ=210nm پر سخت ردعمل تھا، اور علیحدگی کی ڈگری 3.0 تک پہنچ گئی۔ گلوکوز سے متعلقہ مادوں کا تجزیہ کرتے وقت مصنف نے ہائیڈروجن پر مبنی کالم کا استعمال کیا۔ متعدد اہم متعلقہ مادوں - مالٹوز، مالٹوٹریز اور فرکٹوز - میں تفریق کا پتہ لگانے والے کے تحت زیادہ حساسیت تھی، جس کی شناخت کی حد 0.5 پی پی ایم تک کم ہے اور علیحدگی کی ڈگری 2.0-2.5 ہے۔

anion ایکسچینج کالم بنیادی طور پر anionic مادوں جیسے نامیاتی تیزاب اور ہالوجن آئنوں کے تجزیہ کے لیے موزوں ہیں۔ مضبوط کیشن ایکسچینج کالموں میں آئن کے تبادلے کی صلاحیت اور سلیکٹیوٹی زیادہ ہوتی ہے، اور یہ پیچیدہ نمونوں کی علیحدگی اور تجزیہ کے لیے موزوں ہیں۔

مندرجہ بالا صرف مصنف کے اپنے تجربے کے ساتھ مل کر کئی عام مائع کرومیٹوگرافی کالموں کی اقسام اور اطلاق کی حدود کا ایک تعارف ہے۔ اصل ایپلی کیشنز میں کرومیٹوگرافک کالموں کی دوسری خاص قسمیں ہیں، جیسے بڑے تاکنا کرومیٹوگرافک کالم، چھوٹے تاکنے والے کرومیٹوگرافک کالم، افینیٹی کرومیٹوگرافک کالم، ملٹی موڈ کرومیٹوگرافک کالم، الٹرا ہائی پرفارمنس لیکویڈ کرومیٹوگرافک (سپر کرومیٹوگرافک کالم)۔ SFC) وغیرہ۔ وہ مختلف شعبوں میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ مخصوص قسم کے کرومیٹوگرافک کالم کو نمونے کی ساخت اور خصوصیات، علیحدگی کی ضروریات اور دیگر مقاصد کے مطابق منتخب کیا جانا چاہیے۔